[생화학실험] RNA polymerase 분리 정제
[생화학실험] RNA polymerase 분리 정제
[Method]
1. Cell lysis
① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26ml 분주하여 섞는다.
② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6ml lysozyme에 분주한 다음, 66ml PMSF와 33ul leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.)
③ 20min 후, 3ml 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.
④ 20min 후, 50ul PMSF 첨가하고 5.6ml 2M Ammonium Sulfate 첨가한다.
⑤ Total volume 56ml 까지 Buffer LB를 첨가한다.
⑥ 5.6ml 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다.
⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.
⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46ml) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.
⑨ 12.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.
⑩ supernatant는 버리고 17ml lysis buffer (1XBuffer C + 100mM NaCl) 첨가하여 용해시 킨다.
⑪ 투석 시 사용하는 membrane을 미리 D.W에 담근다. (3.3ml/1cm)
⑫ protein solution을 membrane에 넣고 clip으로 잡은 후 4도, chamber에서 O/N
2. Cell Purification
① 단백질을 4도, 12000g에서 20분 Centrifuge한다.
② Supernatant만 비커에 담고 50ul PMSF 첨가한다.
③ Colom에 위의 solution을 흘려보낸다. 흘려나오는 Buffer을 비커에 담는다. (50ml; loading eluent)
④ Washing Buffer 120ml을 흘려보낸다. (200ml ; Washing eluent)
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1. Cell lysis
① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26ml 분주하여 섞는다.
② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6ml lysozyme에 분주한 다음, 66ml PMSF와 33ul leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.)
③ 20min 후, 3ml 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.
④ 20min 후, 50ul PMSF 첨가하고 5.6ml 2M Ammonium Sulfate 첨가한다.
⑤ Total volume 56ml 까지 Buffer LB를 첨가한다.
⑥ 5.6ml 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다.
⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.
⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46ml) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.
⑨ 12.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.
⑩ supernatant는 버리고 17ml lysis buffer (1XBuffer C + 100mM NaCl) 첨가하여 용해시 킨다.
⑪ 투석 시 사용하는 membrane을 미리 D.W에 담근다. (3.3ml/1cm)
⑫ protein solution을 membrane에 넣고 clip으로 잡은 후 4도, chamber에서 O/N
2. Cell Purification
① 단백질을 4도, 12000g에서 20분 Centrifuge한다.
② Supernatant만 비커에 담고 50ul PMSF 첨가한다.
③ Colom에 위의 solution을 흘려보낸다. 흘려나오는 Buffer을 비커에 담는다. (50ml; loading eluent)
④ Washing Buffer 120ml을 흘려보낸다. (200ml ; Washing eluent)
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